细胞培养基础实验指南
基础细胞培养·持续维护
贴壁细胞复苏、传代、冻存及培养条件优化的标准流程。
1实验步骤
- 1细胞复苏：37℃水浴快速摇晃冻存管，1分钟内融化，将细胞悬液转移至含预热培养基的离心管中
- 2离心：800rpm 离心 5 分钟，弃上清
- 3重悬：加入适量完全培养基（含 10% 血清），轻轻吹打重悬
- 4接种：细胞计数后调整密度，接种至培养瓶/皿中，37℃、5% CO₂培养箱培养
- 5换液：次日更换培养基去除残留 DMSO，之后每 2-3 天换液
- 6传代：细胞密度达 80-90% 时进行传代
- 7消化：PBS 洗涤 2 次，加入 0.25% 胰酶（含 EDTA）消化，37℃孵育
- 8终止：加入含血清培养基终止消化
- 9离心：800rpm 离心 5 分钟，弃上清
- 10分瓶：按 1:2 或 1:3 比例传代，补足培养基
- 11冻存：消化离心后，细胞沉淀用冻存液重悬，转移至冻存管，程序降温后-80℃保存
注意事项
- 复苏后尽快换液去除 DMSO，减少对细胞毒性
- 胰酶消化时间不宜过长，一般 1-5 分钟，显微镜下观察细胞变圆即可终止
- 细胞状态差时可用支原体检测排除污染
- 血清需预先灭活（56℃ 30 分钟）用于某些敏感细胞
- 冻存液中 DMSO 浓度 10%，血清浓度 90% 最佳