LIBEREAL
返回方案库

染色质免疫共沉淀（ChIP/ChIP-seq）实验指南

高级分子生物学·2-3天

ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是研究蛋白质与 DNA 相互作用的"金标准"方法。通过特异性抗体富集与目标蛋白（如转录因子、组蛋白修饰）结合的 DNA 片段，结合 qPCR（ChIP-qPCR）或高通量测序（ChIP-seq），可以精准定位蛋白在基因组上的结合位点，解析基因转录调控机制。

1实验步骤

  1. 1【细胞交联与样本制备】
  2. 2细胞培养：培养目标细胞至 80-90% 汇合度（约 1×10⁷ cells）
  3. 3交联：加入 1% 甲醛，室温摇晃 10 分钟，终止反应（甘氨酸 0.125M）
  4. 4洗涤：PBS 洗涤 2 次，液氮速冻，-80℃保存
  5. 5
  6. 6【染色质断裂】
  7. 7细胞裂解：加入细胞裂解缓冲液（含 RNase 抑制剂）
  8. 8超声打断：使用 Bioruptor 或 Covaris 超声破碎，typical settings: 30s ON / 30s OFF, 20-25 cycles
  9. 9验证：取 20μL 样本，蛋白酶 K 消化后电泳检测，DNA 片段应为 200-500bp
  10. 10
  11. 11【免疫沉淀】
  12. 12预清除：加入 Protein A/G beads，4℃旋转 1 小时，减少非特异性
  13. 13一抗孵育：加入目标蛋白特异性抗体（1-5μg），4℃旋转过夜
  14. 14IgG 对照：设置同物种 IgG 作为阴性对照
  15. 15 beads 结合：加入 30μL Protein A/G beads，4℃旋转 2 小时
  16. 16
  17. 17【洗涤与洗脱】
  18. 18低盐洗涤：RIPA 缓冲液洗涤 3 次
  19. 19高盐洗涤：High salt RIPA 洗涤 1 次
  20. 20LiCl 洗涤：LiCl 缓冲液洗涤 1 次（去除非特异性蛋白-DNA 结合）
  21. 21TE 洗涤：TE 缓冲液洗涤 2 次
  22. 22洗脱：加入 Elution Buffer，65℃ 15 分钟洗脱
  23. 23
  24. 24【去交联与 DNA 纯化】
  25. 25去交联：加入 NaCl，65℃ 孵育 4 小时或过夜
  26. 26蛋白酶 K 处理：加入蛋白酶 K，45℃ 30 分钟
  27. 27DNA 纯化：苯酚氯仿抽提或使用 DNA 纯化试剂盒
  28. 28
  29. 29【ChIP-qPCR 或 ChIP-seq】
  30. 30ChIP-qPCR：使用目的基因引物进行 qPCR，计算 Enrichment %
  31. 31ChIP-seq：文库构建（End repair + A-tailing + adapter + PCR），测序