免疫共沉淀（Co-IP）实验指南
高级蛋白研究·1-2天
Co-IP（Co-Immunoprecipitation）是研究蛋白质与蛋白质相互作用的核心方法。利用抗体捕获目标蛋白及其天然结合的蛋白复合物，通过 Western Blot 或质谱（MS）进行鉴定，是探索信号通路上下游关系和蛋白复合物组成的常用手段。
1实验步骤
- 1【细胞裂解（温和条件）】
- 2收集细胞：PBS 洗涤，刮下细胞，4℃离心
- 3裂解缓冲液：使用 NP-40 或 RIPA 缓冲液（不含 SDS），加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂
- 4裂解：冰上裂解 30 分钟，期间轻柔振荡
- 5离心：14000rpm，4℃离心 15 分钟，取上清
- 6蛋白定量：BCA 法测定浓度，调整各样本至相同浓度
- 7
- 8【预清除（减少非特异性）】
- 9加入 20μL Protein A/G beads，4℃旋转 1 小时
- 10离心取上清，此步骤可去除与 beads 非特异性结合的蛋白
- 11
- 12【免疫沉淀】
- 13抗体孵育：加入目标蛋白抗体（1-10μg），4℃旋转过夜
- 14beads 结合：加入 30-50μL Protein A/G beads，4℃旋转 2-4 小时
- 15离心：4℃离心 3000rpm 1 分钟，弃上清
- 16洗涤：依次用裂解缓冲液、低盐缓冲液、高盐缓冲液洗涤各 3 次
- 17
- 18【洗脱与检测】
- 19洗脱：加入 2× Loading Buffer，100℃煮沸 5 分钟
- 20Western Blot：一抗 + 二抗孵育，显影
- 21检测蛋白：通过抗体检测目标蛋白及其潜在互作蛋白
- 22
- 23【质谱分析（可选）】
- 24银染：SDS-PAGE 银染后切取差异条带
- 25胰酶消化：Trypsin 酶解
- 26LC-MS/MS：质谱鉴定蛋白
- 27数据分析：与 IgG 对照比较，筛选特异性互作蛋白
注意事项
- 裂解用 NP-40 缓冲液（不含 SDS），保持蛋白天然构象
- 抗体用量需优化，过多会导致轻链污染，影响检测
- IgG 对照与实验组条件完全一致，用于判断非特异性结合
- 洗涤力度要平衡：太松导致非特异性，太紧可能破坏互作
- 银染检测差异条带时注意背景控制，避免过高背景干扰