CRISPR-Cas9 基因编辑实验指南
高级分子生物学·2-3周
CRISPR-Cas9 是目前最便捷的基因编辑工具，通过 sgRNA 引导 Cas9 核酸酶在特定位点产生 DNA 双链断裂，实现基因敲除、敲入或修饰。广泛应用于功能基因组学研究。
1实验步骤
- 1【sgRNA 设计】
- 2选择靶点：外显子区早期 CDS 序列（PAM: NGG）
- 3避免同源序列和 off-target 预测高危位点
- 4在线工具：CHOPCHOP、CRISPOR、E-CRISP 等
- 5建议设计 3-5 条 sgRNA，筛选切割效率最高的
- 6
- 7【载体构建】
- 8常用载体：pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)、lentiCRISPR v2 等
- 9退火形成双链：sgRNA oligo (100μM) 各 1μL + T4 PNK + Buffer，95℃ 5min，逐渐降温至 25℃
- 10连接：使用 T4 DNA Ligase 连接至线性化载体
- 11转化：DH5α 感受态细胞，氨苄青霉素筛选
- 12测序验证克隆正确性
- 13
- 14【细胞转染/感染】
- 15质粒转染：Lipofectamine 3000 或电转（适合难转染细胞）
- 16或病毒包装：包装 sgRNA-Cas9 载体，感染目标细胞
- 17选择方法：嘌呤霉素（PX459）或潮霉素筛选
- 18
- 19【单克隆筛选】
- 20有限稀释法：96孔板稀释细胞至 0.5-1 cell/well，培养 2-3 周
- 21或流式细胞术分选 GFP+ 单细胞
- 22扩增：单克隆细胞扩大培养，冻存备份
- 23
- 24【敲除效率验证】
- 25基因组 DNA 提取：使用基因组提取试剂盒
- 26T7E1 切割实验：PCR 扩增靶区域，T7E1 酶切割错配位点，电泳分析
- 27TA 克隆测序：克隆 PCR 产物，测序分析 indels 百分比
- 28Western Blot：如蛋白表达量可检测，验证敲除效果
- 29
- 30【敲入实验（如需要）】
- 31设计同源臂：500-1000bp 左右同源臂包裹 HDR 模板
- 32共转染：Cas9 + sgRNA + HDR 模板（线性或环状）
- 33筛选：阳性克隆可用药物筛选或荧光筛选
- 34鉴定：PCR + 测序验证敲入正确性
注意事项
- sgRNA 设计避免 off-target 位点，使用 CHOPCHOP 或 CRISPOR 预测
- Cas9 质粒可同时转染或包装病毒感染，难转染细胞建议用病毒
- 单克隆筛选需设置充足时间（2-3 周），避免过早挑取未生长克隆
- T7E1 切割实验需优化退火温度，PCR 产物应大于 400bp
- 脱靶检测：对预测的高危 off-target 位点进行 Sanger 测序验证