双荧光素酶报告基因实验指南

1实验步骤

1. 1【报告载体构建】
2. 2选择载体：psiCHECK-2（含萤火虫和海肾双报告基因）、pmirGLO（含萤火虫和海肾）、或 pGL3-basic（含萤火虫）
3. 3靶序列选择：
4. 4 - miRNA 靶基因验证：3' UTR 序列（含预测的 miRNA 结合位点）
5. 5 - 转录因子验证：靶基因启动子区域（含转录因子结合位点）
6. 6 - 突变对照：突变 miRNA 结合位点或转录因子结合位点（作为阴性对照）
7. 7克隆方法：
8. 8 - 传统酶切克隆：使用 XhoI/NotI 或多克隆位点酶切连接
9. 9 - 无缝克隆：Gibson Assembly 或 In-Fusion
10. 10 - 合成：直接合成含调控元件的基因片段
11. 11转化与验证：DH5α 感受态细胞转化，氨苄青霉素筛选，测序确认
12. 12
13. 13【细胞接种与共转染】
14. 14细胞选择：HEK293T（转染效率高）或目标细胞
15. 15接种密度：24孔板 60-70% 汇合度
16. 16实验分组：
17. 17 - 实验组：报告载体 + 调控分子（如 miRNA mimics）
18. 18 - 对照组1：报告载体 + NC mimics（验证特异性）
19. 19 - 对照组2：突变报告载体 + 调控分子（验证结合位点）
20. 20 - 空白组：报告载体 only（基线活性）
21. 21转染试剂：Lipofectamine 3000 或 RNAiMAX（如同时转染 siRNA）
22. 22
23. 23【细胞裂解】
24. 24培养时间：37℃培养 24-48 小时
25. 25裂解：吸去培养基，PBS 洗涤 1 次
26. 26被动裂解：加入 100μL Passive Lysis Buffer，室温摇晃 15 分钟
27. 27离心：12000rpm 离心 1 分钟，取上清
28. 28
29. 29【荧光素酶检测】
30. 30萤火虫荧光素酶检测：
31. 31 - 取 20μL 细胞裂解液加入检测板
32. 32 - 加入 100μL 萤火虫荧光素酶检测试剂（Luciferase Reagent）
33. 33 - 读数（FLuc 单位）
34. 34海肾荧光素酶检测：
35. 35 - 加入 100μL Stop & Glo Reagent（终止萤火虫反应并启动海肾反应）
36. 36 - 读数（RLuc 单位）
37. 37计算：RLuc/FLuc 比值代表报告基因活性
38. 38
39. 39【数据处理与分析】