ELISPOT 实验指南

1实验步骤

1. 1板子预处理：用 35% 乙醇或专用激活液浸泡 ELISPOT 板 15 分钟
2. 2包被：用 PBS 稀释的一抗（5-10μg/mL）加入板子，100μL/孔，4℃过夜
3. 3封闭：次日用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基封闭 2 小时（37℃）
4. 4洗涤：PBST 洗板 3 次，再用 PBS 洗 1 次
5. 5接种细胞：将 PBMC 或脾细胞（2×10⁵ - 5×10⁵ 细胞/孔）加入板子
6. 6刺激：根据实验设计加入刺激物（如 PHA 10μg/mL，或特异性抗原肽），37℃ CO₂ 培养箱孵育 24-48 小时
7. 7洗涤：小心去除细胞，用 PBST 洗板 5 次，再用 PBS 洗 2 次
8. 8酶标抗体：加入 HRP 或 AP 标记的二抗（1:200 稀释），37℃孵育 2 小时
9. 9洗涤：PBST 洗板 5 次，再用 PBS 洗 2 次
10. 10显色：加入 AEC 或 TMB 底物溶液，室温避光孵育 15-30 分钟，随时观察显色情况
11. 11终止：用水轻轻冲洗板子终止显色
12. 12拍照与分析：显微镜下拍照，计数斑点形成细胞（SFC），或用专用仪器分析