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荧光原位杂交（FISH）实验指南

中级细胞结构与功能·1-2天

Fluorescence In Situ Hybridization（FISH）是一种利用荧光标记的探针与目标核酸（DNA 或 RNA）原位杂交的技术，可在保持组织/细胞结构的前提下检测特定核酸序列的空间分布。广泛应用于基因组定位、染色体异常检测、RNA 表达定位等研究。

1实验步骤

  1. 1【探针设计与制备】
  2. 2探针设计：针对目标序列设计 30-50nt 寡核苷酸探针，确保特异性
  3. 3标记方式：3' 端或 5' 端生物素标记/荧光素标记（如 FITC、Cy3、Cy5）
  4. 4探针混合：多个探针可混合使用，实现双色或三色 FISH
  5. 5探针保存：-20℃ 避光保存，避免反复冻融
  6. 6
  7. 7【样本准备与固定】
  8. 8细胞爬片：24 孔板放置盖玻片，接种细胞至 60-80% 汇合度
  9. 9组织切片：5-10μm 石蜡切片或冰冻切片，60℃ 烤片 2-4 小时
  10. 10固定：4% PFA 室温固定 10-20 分钟，PBS 洗涤 3 次
  11. 11脱水：梯度乙醇（70%→85%→100%）各 2 分钟，晾干
  12. 12
  13. 13【通透与酶处理】
  14. 14RNA 酶处理（如检测 DNA）：加入 100μg/mL RNase A，37℃ 1 小时，去除 RNA 干扰
  15. 15通透：0.3% Triton X-100 室温 10 分钟，增加探针渗透性
  16. 16蛋白质酶消化（如需要）：蛋白酶 K（0.1μg/mL）37℃ 5-10 分钟
  17. 17
  18. 18【杂交】
  19. 19预杂交：加入预杂交液（SSC + BSA + 鲑鱼精 DNA），37℃ 30 分钟
  20. 20杂交液配制：探针（10-100ng/μL）+ 杂交液（SSC + formamide + 鲑鱼精 DNA）
  21. 21变性：95℃ 5 分钟变性探针，立即冰浴 2 分钟
  22. 22杂交：加入探针混合液，37℃-42℃ 孵育 4-16 小时（根据探针长度和复杂度调整）
  23. 23
  24. 24【洗涤】
  25. 25严格洗涤：SSC 缓冲液梯度洗涤（2×SSC → 1×SSC → 0.5×SSC）
  26. 26温度：洗涤温度需根据探针 Tm 值优化（通常 37-42℃）
  27. 27DAPI 复染：加入 DAPI（1:1000）染核 5 分钟
  28. 28
  29. 29【封片与成像】
  30. 30封片：抗荧光淬灭封片剂封片，避免气泡
  31. 31成像：共聚焦显微镜或荧光显微镜观察
  32. 32多通道：分别拍摄 DAPI 和 FISH 荧光信号，计算共定位