免疫组织化学 (IHC) 实验指南

1实验步骤

1. 1组织取材：新鲜组织取材后立即固定，厚度不超过 3-5mm
2. 2固定：4% PFA 或 10% 中性福尔马林固定 24-48 小时（室温）
3. 3脱水：梯度乙醇脱水（70%→80%→95%→100%），每次 30-60 分钟
4. 4透明：二甲苯透明 2 次，每次 15-30 分钟
5. 5浸蜡：石蜡浸入（60℃熔蜡）3 次，每次 30-60 分钟
6. 6包埋：用石蜡包埋机将组织嵌入模具，4℃冷却凝固
7. 7切片：病理切片机切 3-5μm 薄片，摊片机捞片，60℃烤片 2-4 小时
8. 8脱蜡复水：二甲苯 2 次各 10 分钟 → 100%乙醇 2 次各 5 分钟 → 梯度复水（95%→80%→70%）各 5 分钟 → PBS 5 分钟
9. 9抗原修复：根据抗体选择修复方式，pH 6.0 柠檬酸缓冲液或 pH 9.0 EDTA 缓冲液，高压锅或微波修复 10-15 分钟，自然冷却
10. 10封闭内源性过氧化物酶：3% H₂O₂甲醇溶液孵育 10 分钟，PBS 洗涤 3 次
11. 11封闭：5% BSA 或 10% 正常山羊血清封闭 1 小时（室温）
12. 12一抗孵育：甩掉封闭液，直接加一抗，4℃过夜或室温 2 小时
13. 13洗涤：PBS 或 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟
14. 14二抗孵育：HRP 标记二抗（1:200-1:500），室温孵育 30-60 分钟
15. 15洗涤：PBS 或 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟
16. 16显色：DAB 或 AEC 显色液孵育 1-10 分钟（显微镜下观察控制时间）
17. 17复染：苏木素复染 30 秒 → 盐酸酒精分化 → 流水冲洗返蓝
18. 18脱水透明封片：梯度乙醇脱水 → 二甲苯透明 → 中性树胶封片
19. 19拍照：光学显微镜明场拍照