免疫细胞分离与纯化指南（密度梯度离心法）

1实验步骤

1. 1【Ficoll 分离法（常规方案）】
2. 2血液采集：用肝素抗凝采血管采集外周血 5-10mL，室温保存，4小时内处理
3. 3稀释：用 PBS 或生理盐水 1:1 稀释血液，降低粘度
4. 4分层准备：在 15mL 离心管中先加入 3-5mL Ficoll-Paque Plus（密度 1.077g/mL）
5. 5加样：倾斜离心管，用移液管沿管壁缓慢加入稀释血液（约 5-8mL），保持清晰分层
6. 6离心：室温 400g 离心 30 分钟（升速和降速均设置为 slow brake/无制动）
7. 7收集中间层：用移液管小心吸取中间层云雾状单个核细胞层（泛白色），避免吸到上层血浆
8. 8洗涤：转移至新管，加入 10mL PBS，300g 离心 10 分钟，弃上清
9. 9重复洗涤：重复洗涤 2 次，去除血小板和残留 Ficoll
10. 10细胞计数：重悬于 1mL PBS，用血球计数板计数
11. 11活性检测：台盼蓝染色检测活率，通常 >95%
12. 12
13. 13【Percoll 分离法（梯度方案）】
14. 14Percoll 梯度配制：
15. 15 - 母液：Percoll 原液 + 10× PBS (1:9) 配成 100% Percoll
16. 16 - 制作不连续梯度：40% Percoll (1.06g/mL) + 60% Percoll (1.08g/mL) + 80% Percoll (1.12g/mL)
17. 17血液处理：同上，用 PBS 1:1 稀释
18. 18加样：在梯度管中缓慢加入稀释血液，避免打乱梯度
19. 19离心：室温 500g 离心 30 分钟（无制动）
20. 20收集各层：分别收集 40%/60% 界面（单核细胞）、60%/80% 界面（淋巴细胞）、80% 底层（粒细胞）
21. 21洗涤：各层细胞用 PBS 洗涤 2 次
22. 22注意：Percoll 梯度可分离更精细的细胞亚群，如不同密度的 T/B 细胞
23. 23
24. 24【组织来源单个核细胞分离】
25. 25淋巴结/脾脏：放入含 PBS 的培养皿中，用剪刀剪碎，通过 40μm 滤网研磨
26. 26骨髓：用注射器抽取骨髓，用 PBS 冲洗，通过滤网
27. 27肿瘤组织：剪成 1-2mm 小块，酶消化（胶原酶 + 透明质酸酶）30-60 分钟，离心收集
28. 28后续处理同上，先用 PBS 洗涤，再进行密度梯度分离