免疫荧光染色实验指南
中级细胞成像·1-2天
用于检测细胞或组织中目标蛋白的定位和表达，适用于贴壁细胞和冰冻切片。
1实验步骤
- 1细胞种植：24 孔板或 confocal 小皿中种植细胞，密度 50-70%
- 2固定：PBS 洗涤 3 次，4% 多聚甲醛（PFA）室温固定 15-20 分钟
- 3通透：PBS 洗涤 3 次，0.2% Triton X-100 通透 10 分钟
- 4封闭：5% BSA 或 10% 正常血清（一抗来源）封闭 1 小时
- 5一抗孵育：稀释一抗（用 1% BSA），4℃过夜或室温 2 小时
- 6洗涤：PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟
- 7二抗孵育：稀释荧光二抗（1:500-1:1000），室温避光孵育 1 小时
- 8洗涤：PBS 洗涤 3 次，避光操作
- 9核染色：DAPI（1:1000）复染 5 分钟
- 10封片：PBS 洗涤后，用抗荧光淬灭封片液封片
- 11拍照：尽快用共聚焦显微镜或荧光显微镜拍照
注意事项
- 固定液选择根据抗原特性：PFA 适合大多数蛋白，甲醇适合膜蛋白
- 二抗来源需与一抗宿主动物不同
- 荧光二抗稀释后需离心去除沉淀
- 操作全程避光，防止荧光淬灭
- 阳性对照和阴性对照有助于判断结果可靠性