免疫沉淀 (IP/Co-IP) 实验指南

1实验步骤

1. 1裂解：PBS 洗涤细胞 2 次，加入 IP 裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解 30 分钟
2. 2离心：14000rpm，4℃离心 15 分钟，取上清
3. 3蛋白定量：BCA 法测定浓度，调整各样品浓度一致
4. 4预清除：加入 Protein A/G beads（20μL/样本），4℃旋转 1 小时，减少非特异性结合
5. 5离心：14000rpm，4℃离心 5 分钟，取上清
6. 6一抗孵育：加入一抗（1-10μg），4℃旋转过夜
7. 7结合 beads：加入 30μL Protein A/G beads，4℃旋转 2-4 小时
8. 8洗涤：4℃离心 3000rpm 1 分钟，弃上清，用 IP 裂解液洗 3 次，再用低盐/高盐缓冲液各洗 1 次
9. 9洗脱：加入 2× Loading Buffer，100℃煮沸 5 分钟
10. 10检测：通过 Western Blot 分析沉淀的蛋白