CRISPR lncRNA 功能性筛选实验指南
高级分子生物学·1-2周
CRISPR 功能性筛选利用 CRISPR/Cas9 系统对 lncRNA 进行高通量功能筛选。可使用成对 gRNA 介导的大片段删除，或靶向剪接位点的 CRISPR 文库诱导外显子缺失，实现 lncRNA 的完全敲除。
1实验步骤
- 1【文库选择与设计】
- 2全基因组 CRISPR 文库：如 GeCKO v2，包含 190,000+ gRNA，覆盖 18,000+ 基因和 20,000+ lncRNA
- 3靶向剪接位点文库：设计 gRNA 靶向 lncRNA 外显子-内含子边界，诱导剪接异常
- 4gRNA 设计：每个 lncRNA 设计 3-5 条 gRNA，使用 CRISPRscan 或 CHOPCHOP 优化
- 5文库合成：芯片合成或池合成，含 Illumina 接头序列
- 6
- 7【病毒包装与细胞感染】
- 8文库扩增：DH5α 感受态细胞扩增质粒文库，提取 DNA
- 9包装病毒：293T 细胞共转 Cas9 载体 + gRNA 文库质粒 + 包装质粒
- 10病毒收集：48-72 小时收集上清，浓缩
- 11MOI 测定：确定最佳感染复数（通常 MOI < 0.3 确保单克隆感染）
- 12大规模感染：感染足够量的细胞（建议 > 1000x 文库复杂度）
- 13
- 14【筛选与表型富集】
- 15阴性筛选：培养足够时间，淘汰dead cells，收集基因组 DNA
- 16阳性筛选：加入药物筛选或流式分选特定表型（如 GFP+）
- 17对照组：T0 代细胞（筛选前）vs T_end 代细胞（筛选后）
- 18
- 19【 NGS 文库制备与数据分析】
- 20基因组 DNA 提取：收集细胞（> 1000万），提取基因组 DNA
- 21PCR 扩增：使用特异引物扩增 gRNA 区域（加入 index 和桥接接头）
- 22文库纯化：PAGE 凝胶电泳，切取 300-400bp 区域
- 23测序：Illumina，SE150
- 24数据分析：MAGeCK/RRA 算法计算 gene rank，CRISPRcleanR 去除脱靶效应
- 25验证：对 top hits 进行 individual gRNA 验证
注意事项
- 文库复杂度需 > 1000x，确保覆盖所有 gRNA
- MOI < 0.3 保证单克隆感染，避免多重感染导致假阳性
- 阴性筛选培养足够时间（14-21 天），确保表型充分表达
- 阳性筛选加药浓度需预先确定，诱导充分死亡
- NGS 测序深度 > 50M reads，保证 gRNA 覆盖度