lncRNA 功能获得与缺失研究实验指南
中级分子生物学·1-2天
lncRNA 功能研究的核心策略包括敲低（Knockdown）和过表达（Overexpression）。可使用 siRNA/shRNA 进行敲降，CRISPR-Cas9 进行敲除，或 CRISPRi/CRISPRa 进行转录水平调控，以及 cDNA 克隆进行过表达。
1实验步骤
- 1【lncRNA 敲低（Knockdown）】
- 2siRNA 设计：选择 lncRNA 特异性区域（非重复序列），避免脱靶效应
- 3shRNA 设计：构建 shRNA 表达载体（pLKO.1 或 Tet-On 诱导系统）
- 4转染：Lipofectamine RNAiMAX 转染 siRNA（48-72 小时敲低）
- 5慢病毒感染：包装 shRNA 病毒，感染建立稳定敲低细胞系
- 6验证：qPCR 检测敲低效率 > 70%
- 7
- 8【lncRNA 敲除与调控（Knockout & Regulation）】
- 9CRISPR-Cas9 敲除：设计 gRNA 靶向 lncRNA 启动子或外显子，诱导大片段删除
- 10CRISPRi：使用 dCas9-KRAB 融合蛋白，在转录起始位点（TSS）附近结合，抑制转录
- 11CRISPRa：使用 dCas9-SunTag 或 dCas9-VP64 激活结构域，在 TSS 上游结合，激活转录
- 12验证：qPCR 检测表达变化，Western Blot 检测下游靶基因
- 13
- 14【lncRNA 过表达（Overexpression）】
- 15cDNA 克隆：扩增 lncRNA 全长或特定结构域，克隆至 pcDNA3.1、pLVX 或慢病毒载体
- 16转染：Lipofectamine 3000 转染过表达质粒
- 17稳定细胞系：包装慢病毒，嘌呤霉素筛选，建立稳定过表达细胞系
- 18验证：qPCR 检测过表达效率，Northern Blot 验证转录本大小
- 19
- 20【对照设置】
- 21阴性对照：Scramble siRNA 或空载体
- 22阳性对照：已知敲低/过表达效率的 lncRNA siRNA/载体
- 23拯救实验：敲低 + 过表达回复验证功能特异性
注意事项
- siRNA 设计避免 lncRNA 重复序列区域，选择特异性区域
- CRISPRi 靶向 TSS 上游 200bp，抑制转录起始
- CRISPRa 激活转录需在 TSS 上游 500bp 内放置 gRNA
- 过表达载体用慢病毒可实现稳定细胞系构建
- 拯救实验：敲低 + 过表达回复验证功能特异性