lncRNA 互作分子捕获实验指南
高级分子生物学·2-3天
lncRNA 通过与 DNA、蛋白或 RNA 分子相互作用发挥功能。ChIRP-seq/CHART-seq 用于捕获 lncRNA 结合的 DNA 染色质；ChIRP-MS/RAP-MS 用于捕获 lncRNA 结合的蛋白；RIP-seq 用于验证 lncRNA 与特定 RNA 结合蛋白（RBP）的相互作用。
1实验步骤
- 1【ChIRP-seq / CHART-seq（lncRNA-染色质相互作用）】
- 2探针设计：设计 30-40 个 3'端生物素标记的寡核苷酸探针，覆盖 lncRNA 全长
- 3细胞交联：4% 甲醛交联 10 分钟，终止反应（甘氨酸）
- 4细胞裂解：细胞核分离，染色质超声打断（200-500bp）
- 5杂交：探针与染色质在 37℃杂交 4 小时
- 6链霉亲和素磁珠捕获：捕获探针-lncRNA-染色质复合物
- 7洗涤：严格洗涤去除非特异性结合
- 8DNA 洗脱：蛋白酶 K 消化，苯酚氯仿抽提获取 DNA
- 9文库构建：End repair + A-tailing +接头连接 + PCR
- 10测序与分析：Illumina 测序，MACS 分析 peak，motif 分析
- 11
- 12【ChIRP-MS / RAP-MS（lncRNA-蛋白相互作用）】
- 13探针设计：同上，针对 lncRNA 设计生物素探针
- 14交联与裂解：轻交联（UV 254nm）5 分钟，细胞裂解
- 15杂交与捕获：探针与细胞裂解液杂交，链霉亲和素磁珠捕获
- 16洗涤：严格洗涤去除非特异性蛋白
- 17蛋白洗脱：蛋白酶 K 消化，Trypsin 酶解
- 18质谱检测：LC-MS/MS 鉴定蛋白
- 19数据分析：与 IgG 对照比较，筛选特异性结合蛋白
- 20
- 21【RIP-seq（lncRNA-RBP 相互作用验证）】
- 22抗体选择：选择目标 RBP 的特异性抗体 + IgG 对照
- 23细胞裂解：RIPA 缓冲液裂解，RNA 酶抑制剂保护
- 24免疫沉淀：抗体磁珠 4℃孵育 2 小时
- 25洗涤：低盐/高盐缓冲液洗涤，去除非特异性结合
- 26RNA 洗脱：蛋白酶 K + 苯酚氯仿抽提获取 RNA
- 27qPCR 检测：检测目标 lncRNA enrichment
- 28建库测序（如需要）：将捕获的 RNA 进行文库构建和高通量测序
注意事项
- 探针设计覆盖 lncRNA 全长，30-40 条探针效果最佳
- 交联程度影响 ChIRP 效率，过度交联会导致背景增加
- 磁珠捕获后严格洗涤，高盐和 LiCl 可去除非特异性结合
- IgG 对照设置必不可少，用于扣除背景信号
- 蛋白洗脱用 Trypsin 酶解，LC-MS/MS 鉴定需设置复孔