lncRNA 亚细胞定位实验指南
中级分子生物学·3-4小时
lncRNA 的亚细胞定位决定了其作用模式。核内 lncRNA 主要参与染色质修饰和转录调控，细胞质 lncRNA 主要作为 ceRNA 或调控翻译。通过核质分离 qPCR 或 RNA-FISH 确定 lncRNA 的定位。
1实验步骤
- 1【细胞核-细胞质分离】
- 2细胞收集：PBS 洗涤，刮下细胞，4℃离心
- 3细胞裂解：使用 NP-40 裂解缓冲液（含 RNase 抑制剂）
- 4低速离心：700g 4℃离心 5 分钟，上清为胞质部分
- 5核沉淀洗涤：核沉淀用裂解缓冲液洗涤 2 次
- 6分别提取 RNA：TRIzol 分别提取核 RNA 和胞质 RNA
- 7注意：整个操作 4℃进行，防止 RNase 降解
- 8
- 9【核质分离 qPCR 检测】
- 10逆转录：分别对核 RNA 和胞质 RNA 进行逆转录
- 11qPCR：检测目标 lncRNA 和对照基因
- 12对照基因：
- 13 - 胞质对照：GAPDH、ACTB（胞质富集）
- 14 - 核对照：NEAT1、MALAT1（核富集）
- 15计算：核/胞质比例，判断 lncRNA 主要定位
- 16
- 17【RNA-FISH（荧光原位杂交）】
- 18探针设计：设计 30-50nt 生物素或荧光素标记的寡核苷酸探针
- 19细胞固定：4% PFA 固定细胞爬片，PBS 洗涤
- 20通透：0.3% Triton X-100 通透 10 分钟
- 21杂交：探针与细胞在 37℃杂交过夜
- 22洗涤：SSC 缓冲液洗涤，去除未结合探针
- 23检测：荧光二抗（Streptavidin-Cy3 或抗荧光素抗体）
- 24核染色：DAPI 染核
- 25成像：共聚焦显微镜观察荧光信号定位
注意事项
- 核质分离全程 4℃ 操作，防止 RNase 降解 RNA
- 核沉淀洗涤轻柔，避免核膜破裂导致核内 RNA 污染胞质
- NEAT1 和 MALAT1 作为核定位对照，胞质 fraction 不应检出
- GAPDH 和 ACTB 作为胞质定位对照，核 fraction 不应检出
- RNA-FISH 探针设计避免与重复序列结合，防止非特异性信号