lncRNA 全转录组测序（Whole Transcriptome Sequencing）实验指南
中级分子生物学·2-3天
全转录组测序采用 Ribo-zero 链特异性建库方法，可同时鉴定和定量 lncRNA、mRNA 和 circRNA，分析它们之间的共表达或靶向调控网络（如 ceRNA 网络），是发现和筛选 lncRNA 的首选方法。
1实验步骤
- 1【样本准备与 RNA 提取】
- 2细胞/组织收集：新鲜样本液氮速冻，-80℃保存
- 3total RNA 提取：TRIzol 或 miRNeasy Kit，注意避免 RNase 污染
- 4RNA 质控：Agilent Bioanalyzer 检测 RIN > 8.0，28S/18S > 1.5
- 5浓度测定：Nanodrop/Qubit，确保 > 5μg total RNA
- 6
- 7【rRNA 去除（Ribo-zero）】
- 8去除核糖体 RNA：使用 Ribo-Zero Kit 去除 rRNA（28S、18S、5S）
- 9或使用 Poly(A) 捕获 mRNA + 去除 rRNA 的组合方法
- 10质控：检测 rRNA 去除效率 > 95%
- 11
- 12【链特异性文库构建】
- 13片段化：使用二价金属离子或酶法将 RNA 打断为 150-200nt 片段
- 14逆转录：使用链特异性逆转录酶，合成第一链 cDNA
- 15第二链合成：加入 dUTP 标记第二链（保持链特异性）
- 16接头连接：两端连接 Illumina 接头
- 17PCR 扩增：使用 index 引物进行 12-15 个循环扩增
- 18文库质控：Agilent Bioanalyzer 检测文库大小分布（200-500bp）
- 19
- 20【测序与数据分析】
- 21上机测序：Illumina NovaSeq/NextSeq，PE150 或 PE125
- 22数据预处理：去除接头、低质量 reads、rRNA 污染 reads
- 23比对：将 clean reads 比对到参考基因组（STAR/HISAT2）
- 24转录本组装：StringTie/Cufflinks 进行组装
- 25lncRNA 鉴定：筛选长度 > 200nt、不编码蛋白、具有保守二级结构的转录本
- 26定量：FPKM/TPM 定量 lncRNA 和 mRNA 表达
- 27差异分析：DESeq2/edgeR 进行组间差异分析
- 28ceRNA 网络分析：使用 miRanda/TargetScan 预测 miRNA-lncRNA-mRNA 轴
- 29共表达分析：WGCNA 构建基因共表达网络，解析 lncRNA 功能
注意事项
- Ribo-zero 去除 rRNA 效率 > 95%，不足时会影响 lncRNA 检出
- 链特异性文库构建可保留正义链信息，区分 lncRNA 天然正义链
- 文库片段化控制在 150-200bp，过长会导致测序质量下降
- 测序深度 PE150 建议 > 30M reads，保证低丰度转录本覆盖
- lncRNA 鉴定需去除编码蛋白的转录本（长度 > 200nt）