体液 miRNA 超敏检测（SE-SPTM-PCR）实验指南

1实验步骤

1. 1【体液样本收集与处理】
2. 2血液采集：使用 EDTA 或血清分离管，采集后 30 分钟内处理
3. 3离心：1500g 离心 10 分钟，取血浆/血清，避免溶血
4. 4分装：-80℃分装保存，避免反复冻融（最多 3 次）
5. 5尿液：收集中段晨尿，3000g 离心 10 分钟，取上清 -80℃保存
6. 6
7. 7【miRNA 提取（富集 small RNA）】
8. 8体积排除法：使用 miRNAeasy Serum/Plasma Kit 等通过柱子选择性结合 small RNA
9. 9酸酚法：TRIzol LS 用于体液样本，提取 total RNA（包括 small RNA）
10. 10carrier RNA：提取时加入外源 miRNA（如 cel-miR-39）作为提取对照
11. 11质控：检测260/280 ratio，OD230 等指标
12. 12
13. 13【SE-SPTM-PCR 超敏检测】
14. 14选择性问题探针：设计针对目标 miRNA 的探针（带生物素标记）
15. 15探针-目标杂交：样本 RNA 与探针杂交，目标 miRNA 与探针特异性结合
16. 16富集：通过链霉亲和素磁珠捕获杂交复合物
17. 17洗涤：去除非特异性结合
18. 18茎环 qPCR：对富集的 miRNA 进行逆转录和 qPCR 检测
19. 19信号放大：由于富集步骤，检测灵敏度可提高 100-1000 倍
20. 20
21. 21【标准曲线与定量】
22. 22合成 miRNA 标准品：人工合成目标 miRNA 序列
23. 23梯度稀释：10fM 到 10pM 系列稀释
24. 24建立标准曲线：绘制 Ct 值与浓度的关系
25. 25绝对定量：根据标准曲线计算样本中 miRNA 的绝对浓度（fM）
26. 26
27. 27【质量控制】
28. 28提取对照：cel-miR-39 用于监测提取效率（加入量已知，回收率 80-120%）
29. 29RT 效率：使用 U6 或其他内参校正
30. 30阴性对照：健康样本 pool 作为阴性对照
31. 31阳性对照：已知浓度的人工合成 miRNA