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miRNA 提取与纯化实验指南

基础分子生物学·2-3小时

miRNA 是一种长度约 20-24nt 的内源性小 RNA，与蛋白质形成复合物后在体液和组织中稳定存在。miRNA 提取是后续表达谱分析、定量检测和功能研究的基础。适用于细胞、组织、血浆、血清等多种样本类型。

1实验步骤

  1. 1【样本收集与保存】
  2. 2细胞样本：PBS 洗涤 2 次，收集细胞沉淀，-80℃保存或立即提取
  3. 3组织样本：新鲜组织切成 50-100mg 小块，液氮速冻，-80℃保存
  4. 4血浆/血清：EDTA 抗凝管采集，1500g 离心 10 分钟取上清，-80℃分装保存
  5. 5注意：避免反复冻融，血浆样本尤其重要
  6. 6
  7. 7【细胞/组织 miRNA 提取（TRIzol 法）】
  8. 8裂解：加入 1mL TRIzol，室温孵育 5 分钟使细胞完全裂解
  9. 9分相：加入 200μL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温孵育 3 分钟
  10. 10离心：12000g 4℃离心 15 分钟，溶液分为三层
  11. 11取水相：小心吸取上层水相（含 small RNA），转移至新管
  12. 12沉淀：加入 500μL 异丙醇，室温孵育 10 分钟
  13. 13离心：12000g 4℃离心 10 分钟，弃上清
  14. 14洗涤：加入 1mL 75% 乙醇洗涤沉淀，8000g 4℃离心 5 分钟
  15. 15溶解：弃乙醇，室温干燥 5-10 分钟，加入 30-50μL RNase Free 水溶解
  16. 16
  17. 17【血浆/血清 miRNA 提取（专用试剂盒法）】
  18. 18血浆解冻：冰上解冻样本，避免剧烈晃动
  19. 19加入 carrier RNA：加入 1μg carrier RNA（提高回收率）
  20. 20裂解：加入 TRIzol LS 1mL，混匀，室温孵育 5 分钟
  21. 21后续步骤：同上 TRIzol 法，进行分相、沉淀、洗涤
  22. 22
  23. 23【miRNA 提取试剂盒法（miRNeasy）】
  24. 24裂解：细胞/组织加入 QIAzol 裂解液，匀浆或超声破碎
  25. 25抽提：加入氯仿，振荡，离心取水相
  26. 26结合：加入 1.5 倍体积无水乙醇，混合后过柱
  27. 27洗涤：依次用 RWT 和 RPE 缓冲液洗涤
  28. 28洗脱：RNase Free 水洗脱，得到含 miRNA 的 total RNA
  29. 29
  30. 30【miRNA 质控】
  31. 31浓度测定：Nanodrop/Qubit 测定浓度，OD260/280 ≈ 2.0
  32. 32完整性检测：Agilent Bioanalyzer Small RNA chip，检测 18-30nt small RNA 峰
  33. 33A260/A230 > 2.0：无酚/盐污染
  34. 34保存：-80℃保存，避免反复冻融

注意事项

  • 体液样本避免溶血，溶血会导致 miRNA 降解和污染
  • carrier RNA（如 cel-miR-39）用于监测提取效率，回收率 80-120%
  • small RNA 在异丙醇沉淀时需加入糖原助沉淀，防止丢失
  • 血浆/血清 miRNA 浓度低，建议用专用试剂盒富集 small RNA
  • miRNA 保存加 RNase 抑制剂，-80℃ 保存避免反复冻融