miRNA mimics/inhibitors 转染实验指南
中级分子生物学·1-2天
miRNA mimics（模拟物）和 inhibitors（抑制剂）是 miRNA 功能研究的核心工具。mimics 用于过表达 miRNA（功能获得），inhibitors 用于封闭内源 miRNA（功能缺失）。也可使用 miRNA sponges 实现长效封闭。
1实验步骤
- 1【miRNA mimics 转染（功能获得）】
- 2设计/选择：使用已验证的 mimic 序列（通常 2'-O-methyl 修饰增强稳定性）
- 3细胞接种：6孔板接种 0.5-1×10⁵ cells/well，37℃培养至 60-80% 汇合度
- 4复合物配制：Opti-MEM 稀释 mimics (30-100nM) + Lipofectamine RNAiMAX
- 5转染：加入复合物，37℃培养 24-72 小时
- 6效果检测：48 小时后 qPCR 检测过表达效果，Western Blot 检测下游靶基因变化
- 7
- 8【miRNA inhibitors 转染（功能缺失）】
- 9设计/选择：antimiR 或 miRNA inhibitor，单链LNA或2'-O-methyl修饰
- 10细胞接种：同上
- 11复合物配制：Opti-MEM 稀释 inhibitors (50-200nM) + Lipofectamine RNAiMAX
- 12转染：同上
- 13效果检测：qPCR 检测敲低效果，Western Blot 检测靶基因表达上调
- 14
- 15【miRNA sponges（长效封闭）】
- 16设计：合成包含多个 miRNA 结合位点的 RNA 序列（每个位点间隔 4nt）
- 17载体构建：克隆至慢病毒表达载体（如 pLVX-miR-Sponge）
- 18包装病毒：293T 细胞包装慢病毒
- 19感染：感染目标细胞，嘌呤霉素筛选建立稳定细胞系
- 20验证：qPCR 检测 sponge 表达水平，功能验证封闭效果
- 21
- 22【阳性/阴性对照】
- 23阳性对照：已知有效 mimic/inhibitor 的 miRNA（如 miR-21）
- 24阴性对照： scrambled sequence (NC mimic/inhibitor)
- 25 transfection control: FAM 标记 NC mimic 监测转染效率
注意事项
- mimics 和 inhibitors 转染浓度需优化，过高会导致细胞毒性
- FAM 标记的 NC mimic 可监测转染效率，确保 > 80% 细胞发光
- mimics 过表达效果检测在 48 小时，inhibitors 敲低在 72 小时
- 阳性对照 miRNA 选 miR-21 或 let-7a，已知效果稳定
- 多个 mimics 同时转染时注意总浓度不要过高