miRNA qPCR 检测（LNA 茎环法）实验指南

中级分子生物学·4-5小时

LNA（锁核酸）修饰的茎环 qPCR 是 miRNA 定量的金标准方法。LNA 修饰可增强引物与 miRNA 的结合亲和力，实现对单碱基差异 miRNA 的高特异性检测，灵敏度可达 10 拷贝。

1实验步骤

1【逆转录反应（茎环法）】
2设计茎环逆转录引物：针对目标 miRNA 序列设计特异性 RT primer（包含通用茎环结构）
3RT 反应体系：total RNA 1-2μg，RT primer 1μL，逆转录酶 1μL，dNTP 2μL，5× Buffer 4μL，RNase Free 水补至 20μL
4RT 程序：16℃ 30min → 42℃ 60min → 70℃ 10min → 4℃ Hold
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6【qPCR 检测】
7设计 qPCR 引物：Forward primer 为 miRNA 序列的前 10-12nt，Reverse primer 为通用茎环序列
8LNA 修饰：miRNA Forward primer 建议进行 LNA 修饰，提高Tm值和特异性
9qPCR 体系：cDNA 2μL，Forward primer (5μM) 1μL，Reverse primer (5μM) 1μL，SYBR Green Master Mix 10μL，水补至 20μL
10qPCR 程序：95℃ 2min → (95℃ 15s → 60℃ 30s) × 40 cycles → 熔解曲线
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12【数据处理】
13Ct 值判定：以目的 miRNA 的 Ct 值 - 内参（如 U6/snRNA）的 Ct 值 = ΔCt
14相对定量：2^(-ΔΔCt) 法计算表达量变化
15特异性验证：熔解曲线应为单峰，Tm 值与预期一致
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17【注意事项】
18必须设置无模板对照（NTC）和无逆转录酶对照（RT-）
19每个样本设 3 个技术复孔，CV 值应 <5%
20茎环法只能检测有序列信息的 miRNA，新发现的 miRNA 需先设计引物