miRNA 表达谱分析（miRNA-seq）实验指南
中级分子生物学·2-3天
miRNA-seq 是目前最全面的 miRNA 表达谱分析技术，能够检测样本中所有 miRNA 的表达丰度，发现新 miRNA 以及 isomiRs（序列变体）。比微阵列芯片灵敏度更高，可定量低丰度 miRNA。
1实验步骤
- 1【样本准备】
- 2细胞/组织收集：新鲜样本迅速冷冻于液氮，-80℃保存
- 3total RNA 提取：使用 miRNeasy Mini Kit 或 TRIzol，保存于 -80℃
- 4RNA 质控：Agilent Bioanalyzer 或 Fragment Analyzer 检测 RIN 值 >7.0
- 5浓度测定：Nanodrop/Qubit 定量，确保 >1μg total RNA
- 6
- 7【small RNA 文库构建】
- 8接头连接：在 3'端和 5'端依次连接接头（使用 T4 RNA Ligase）
- 9反转录：使用 RT 引物进行逆转录，合成第一链 cDNA
- 10PCR 扩增：使用含 barcode 的引物进行 12-15 个循环的 PCR
- 11文库纯化：PAGE 凝胶（6-8%）电泳分离，切取 140-160bp 区域（对应 18-30nt miRNA）
- 12文库质控：Agilent Bioanalyzer 检测文库大小分布和浓度
- 13
- 14【测序与数据分析】
- 15上机测序：Illumina NovaSeq/NextSeq，SE50 或 SE75
- 16数据预处理：去除接头序列、低质量 reads、长度过滤（18-35nt）
- 17比对：将 clean reads 比对到 miRBase、GENCODE 等 miRNA 数据库
- 18定量：使用 RPM/TPM 定量 miRNA 表达水平
- 19差异分析：DESeq2/edgeR 进行组间差异分析（Fold change >2, p < 0.05）
- 20isomiRs 分析：检测 miRNA 序列的末端修饰和变异
- 21新 miRNA 预测：对无法比对到已知 miRNA 的 reads 进行折叠分析，预测novel miRNA
- 22下游分析：Target prediction、KEGG/GO 富集分析、PPI 网络构建
注意事项
- RNA 质量要求 RIN > 7.0，浓度 > 1μg 才能进行文库构建
- 接头连接效率受 RNA 片段化程度影响，接头需完全去除杂质
- PCR 循环数控制在 12-15 轮，过多会导致文库偏好性
- 文库大小切胶范围 140-160bp，对应 18-30nt miRNA
- 测序深度建议 > 10M reads，保证低丰度 miRNA 的检测