miRNA 靶基因预测与验证实验指南

1实验步骤

1. 1【生物信息学靶基因预测】
2. 2常用数据库：TargetScan（保守性预测）、miRanda（结合自由能）、miRDB（功能注释）
3. 3预测内容：miRNA 结合位点（seed region: 2-8nt）、保守性、AU 含量、UTR 长度
4. 4筛选标准：选择 score 高、保守性好的候选靶基因
5. 5交叉验证：用多个数据库取交集，提高预测可靠性
6. 6功能富集：KEGG/GO 分析预测靶基因参与的通路
7. 7
8. 8【双荧光素酶报告基因实验】
9. 9构建报告载体：
10. 10 - 将靶基因 3' UTR（含 miRNA 结合位点）克隆至 psiCHECK-2 载体的海肾荧光素酶基因下游
11. 11 - 或构建突变型 UTR（突变 miRNA 结合位点）作为阴性对照
12. 12细胞接种：HEK293T 或目标细胞，24孔板 60-70% 汇合度
13. 13共转染：
14. 14 - 实验组：psiCHECK-2-3'UTR + miRNA mimics
15. 15 - 对照组：psiCHECK-2-3'UTR + NC mimics
16. 16 - 突变组：psiCHECK-2-mut-3'UTR + miRNA mimics
17. 17培养：37℃培养 24-48 小时
18. 18裂解： Passive Lysis Buffer 裂解细胞
19. 19检测：Dual-Luciferase Reporter Assay System 检测萤火虫和海肾荧光素酶活性
20. 20计算：海肾/萤火虫 比值（RLuc/FLuc）代表报告基因活性
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22. 22【内源性靶基因验证】
23. 23mRNA 水平：qPCR 检测靶基因 mRNA 表达变化
24. 24蛋白水平：Western Blot 检测靶蛋白表达变化
25. 25预期结果：过表达 miRNA → 靶基因 mRNA 降解或翻译抑制 → 蛋白表达下降
26. 26注意：如果仅抑制翻译而不降解 mRNA，蛋白下降但 mRNA 不变
27. 27
28. 28【功能验证（可选）】
29. 29 Rescue 实验：inhibitor 封闭 miRNA 同时过表达靶基因，验证表型是否恢复
30. 30染色质免疫沉淀（如靶基因是转录因子）：ChIP-qPCR 验证转录调控