分子克隆与重组蛋白表达实验指南

1实验步骤

1. 1【目的基因获取与引物设计】
2. 2引物设计：两端添加限制性内切酶位点或同源臂（20-25bp）
3. 3高保真 PCR：使用高保真 DNA 聚合酶扩增目的基因
4. 4纯化：PCR 产物电泳后切胶纯化
5. 5
6. 6【载体准备】
7. 7选择载体：根据表达系统选择（细菌：pET 系列；酵母：pPICZα；哺乳动物：pcDNA3.1、pLVX）
8. 8酶切：使用相应限制性内切酶线性化载体
9. 9纯化：凝胶回收纯化
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11. 11【连接反应】
12. 12传统酶连：T4 DNA Ligase，16℃过夜
13. 13无缝克隆：Gibson Assembly 或 In-Fusion，50℃ 30 分钟
14. 14转化：连接产物转化 DH5α 感受态细胞
15. 15抗性筛选：含相应抗生素的 LB 平板筛选
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17. 17【重组载体验证】
18. 18 Colony PCR：快速鉴定阳性克隆
19. 19酶切验证：双酶切确认插入片段大小正确
20. 20测序：Sanger 测序确认序列正确
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22. 22【重组蛋白表达】
23. 23原核表达：转化 Rosetta/BL21(DE3)，0.5mM IPTG 诱导 4-6 小时
24. 24真核表达：转染 HEK293T 或 CHO 细胞，或包装慢病毒感染建立稳定细胞系
25. 25表达检测：Western Blot 或 ELISA 检测蛋白表达
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27. 27【蛋白纯化】
28. 28标签选择：His-tag（Ni-NTA）、GST-tag（Glutathione Sepharose）、MBP-tag（Amylose Resin）
29. 29细胞破碎：超声或溶菌酶裂解
30. 30亲和纯化：使用对应树脂进行亲和层析
31. 31去除标签：如有需要，使用相应蛋白酶切除标签
32. 32纯度检测：SDS-PAGE 染色确认纯度