PCR/RT-PCR 实验指南

1实验步骤

1. 1引物设计：使用专业软件（如 Primer Premier 5）设计，长度 18-25bp，GC 含量 40-60%，避免连续 4 个相同碱基
2. 2RNA 提取：使用 Trizol 或商品化 RNA 提取试剂盒，收集细胞或组织
3. 3逆转录：使用逆转录酶和 Oligo(dT) 或随机引物，反应体系：RNA 1μg，逆转录酶 1μL，dNTP 2μL，缓冲液 4μL，RNase Free 水补至 20μL
4. 4逆转录程序：25℃ 5分钟，42℃ 50分钟，70℃ 15分钟
5. 5PCR 体系：模板 cDNA 2μL，上下游引物各 1μL，2× Master Mix 12.5μL，灭菌水补至 25μL
6. 6PCR 程序：94℃ 3分钟预变性；94℃ 30秒，55-60℃ 30秒（根据引物 Tm 值调整），72℃ 30秒/1kb，循环 30-35 次；72℃ 5分钟延伸
7. 7电泳检测：1.5% 琼脂糖凝胶，100V 电泳 30 分钟，EB 或替代染料染色
8. 8成像：凝胶成像系统拍照，分析条带大小和亮度