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qRT-PCR（实时荧光定量 PCR）实验指南

基础分子生物学·4-5小时

qRT-PCR（实时荧光定量 PCR）是检测特定基因 mRNA 表达水平最灵敏、最经济的"金标准"方法。通过荧光染料（如 SYBR Green）或探针（如 TaqMan）实时监测 PCR 扩增产物量，用于基因表达分析、临床诊断和病原体检测。

1实验步骤

  1. 1【RNA 提取与质量控制】
  2. 2RNA 提取：TRIzol 或商品化 RNA 提取试剂盒
  3. 3浓度测定：Nanodrop/Qubit，OD260/280 ≈ 2.0
  4. 4完整性检测：Agilent Bioanalyzer RIN > 8.0
  5. 5基因组 DNA 去除：DNase I 处理
  6. 6
  7. 7【cDNA 合成（逆转录）】
  8. 8体系：total RNA 1-2μg，Oligo(dT) 或 Random Primer，PrimeScript RT Master Mix 10μL，RNase Free 水补至 20μL
  9. 9程序：37℃ 15分钟 → 85℃ 5秒 → 4℃ Hold
  10. 10稀释：cDNA 1:5 或 1:10 稀释后作为 qPCR 模板
  11. 11
  12. 12【引物设计与验证】
  13. 13原则：产物长度 80-200bp，Tm 57-63℃，GC 40-60%
  14. 14跨外显子连接区：避免基因组 DNA 污染干扰
  15. 15特异性验证：熔解曲线单峰表示引物特异性好
  16. 16效率验证：标准曲线 R² > 0.99，扩增效率 90-110%
  17. 17
  18. 18【qPCR 反应】
  19. 19SYBR Green 法：cDNA 2μL，Forward/Reverse primer (10μM) 各 0.4μL，SYBR Premix Ex Taq II 10μL，RNase Free 水 7.2μL
  20. 20TaqMan 探针法：cDNA 2μL，探针 0.5μL，Primer 各 0.9μL，Master Mix 10μL，水补至 20μL
  21. 21程序：95℃ 2min → (95℃ 15s → 60℃ 30s) × 40 cycles → 熔解曲线（SYBR）或 4℃ Hold（TaqMan）
  22. 22
  23. 23【数据计算与分析】
  24. 24Ct 值判定：阈值线在扩增曲线指数期，读取各孔 Ct 值
  25. 25内参选择：GAPDH、β-actin、18S rRNA 等，常用 2^-ΔΔCt 法
  26. 26相对定量：ΔCt = Ct(目的基因) - Ct(内参)，ΔΔCt = ΔCt(实验组) - ΔCt(对照组)
  27. 27表达变化：2^-ΔΔCt 表示相对于对照组的表达倍数
  28. 28严格对照：NTC（无模板对照）确保无污染，标准品绘制标准曲线（绝对定量）

注意事项

  • 引物设计跨外显子连接区，避免基因组 DNA 污染干扰
  • 熔解曲线单峰代表特异性好，多峰提示有非特异性扩增
  • 标准曲线 R² > 0.99，扩增效率 90-110% 才可使用
  • cDNA 模板稀释 1:5 或 1:10，避免高浓度导致非特异性扩增
  • 内参基因建议使用 GAPDH 或 β-actin，避免使用 18S rRNA（表达太高）