放射免疫测定 (RIA) 实验指南

1实验步骤

1. 1原理：竞争性结合反应，未标记抗原与放射性标记抗原（¹²⁵I 或 ³H）竞争结合有限量抗体
2. 2缓冲液配制：PBS (0.05M, pH 7.4) + 0.1% BSA + 0.1% NaN₃ 作为 assay buffer
3. 3标准曲线设置：取系列稀释的标准抗原（0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ng/mL），各设复孔
4. 4样品处理：血清样本 4℃ 离心 3000rpm 10 分钟，取上清待测；组织样本需匀浆、离心取上清
5. 5加样：各管加入 100μL 标准品或待测样品
6. 6加入标记抗原：加入 100μL ¹²⁵I 标记抗原（约 20,000 cpm），振荡混匀
7. 7加入抗体：加入 100μL 抗血清（按最优稀释度），振荡混匀
8. 8孵育：4℃ 孵育 24-48 小时（塑料管需预处理防止非特异性吸附）
9. 9分离结合与游离部分：
10. 10 方法一（双抗体法）：加入第二抗体（如羊抗兔 IgG），37℃ 孵育 1 小时，离心 3000rpm 15 分钟，弃上清
11. 11 方法二（PEG 沉淀法）：加入 20% PEG 6000，混匀，离心 3000rpm 15 分钟，弃上清
12. 12 方法三（活性炭吸附法）：加入活性炭悬液，离心，收集上清（结合部分）
13. 13放射性测定：使用 γ 计数器（¹²⁵I）或 β 液闪仪（³H）测定各管放射性计数（cpm）
14. 14数据处理：以标准品浓度为横坐标，B/T%（结合率）为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品浓度