shRNA 病毒包装与感染指南
高级分子生物学·1周
shRNA（short hairpin RNA）通过质粒或病毒载体导入细胞，可在细胞内持续表达并进行稳定敲降。慢病毒包装可实现高效感染和稳定细胞系构建。
1实验步骤
- 1【shRNA 载体构建】
- 2设计 shRNA 序列：19-29nt 靶序列 + loop (5-8nt) + 反向重复序列
- 3常用载体：pLKO.1、pSuper-retro、pGIPZ 等
- 4或购买已验证的 shRNA 克隆
- 5
- 6【病毒包装（293T 细胞）】
- 7接种 293T：10cm 皿接种 5×10⁶ cells，37℃培养至 80% 汇合度
- 8转染前一天换液（无双抗完全培养基）
- 9转染复合物配制：
- 10 - A 液：DMEM + shRNA 质粒 + 包装质粒（psPAX2） + 包膜质粒（pMD2.G）
- 11 - B 液：DMEM + PEI（1:3 比例，μg:μL）
- 12 - 混合 A+B，室温孵育 20 分钟
- 13加入复合物到 293T 细胞，培养 6-8 小时后换液
- 14
- 15【病毒收集】
- 1648 小时后收集上清（含病毒），4000rpm 离心 10 分钟去除细胞碎片
- 17可更换新培养基继续培养，72 小时再次收集
- 18病毒上清 4℃ 保存（1周）或-80℃ 长期保存
- 19
- 20【病毒浓缩（如需要高滴度）】
- 21超速离心：100,000g，4℃离心 2 小时，弃上清，病毒沉淀用培养基重悬
- 22或使用病毒浓缩试剂盒
- 23
- 24【感染目标细胞】
- 25接种目标细胞（根据 MOI 计算细胞数），加入病毒上清 + Polybrene（8μg/mL）
- 26感染 24 小时后换液
- 27嘌呤霉素筛选（2-5μg/mL），建立稳定细胞系
- 28验证敲降效果（qPCR + WB）
注意事项
- 293T 细胞状态要好，融合度 80-90% 时转染效率最高
- 质粒比例：shRNA : psPAX2 : pMD2.G = 1 : 1 : 0.5（质量比）
- PEI 转染试剂与 DNA 比例 3:1，μg:μL
- 病毒上清 4℃ 可保存 1 周，-80℃ 可长期保存，避免反复冻融
- 嘌呤霉素筛选浓度需预先确定，通常 2-5 μg/mL