单细胞测序与空间组学技术实验指南

1实验步骤

1. 1【单细胞悬液制备】
2. 2组织处理：新鲜组织剪刀剪碎，酶消化（胶原酶 IV + 透明质酸酶）
3. 3过滤：使用 40μm 细胞滤网去除团块
4. 4红细胞裂解：如需要，RBC Lysis Buffer 处理
5. 5活率检测：台盼蓝染色，活率 >85%
6. 6浓度调整：700-1200 cells/μL
7. 7
8. 8【10× Genomics 单细胞 RNA-seq】
9. 9细胞加载：Chromium Controller 将单个细胞与 Gel Beads + 酶混合物包裹在油滴中
10. 10GEMs 形成：每个油滴形成一个 GEM，包含一个细胞
11. 11逆转录：GEMs 中进行逆转录，生成 cDNA
12. 12破油回收：加入破裂液，回收 cDNA
13. 13文库构建：PCR 扩增 + 片段化 + 接头连接
14. 14测序：Illumina NovaSeq，SE75 或 PE150
15. 15数据分析：Cell Ranger → Seurat → 细胞注释
16. 16
17. 17【单细胞 ATAC-seq（染色质可及性）】
18. 18细胞核制备：通透细胞核，染色质开放
19. 19Tn5 转座：标记开放染色质区域
20. 20文库构建：PCR 扩增带有 index 的片段
21. 21测序与分析：解析单细胞层面的染色质开放状态
22. 22
23. 23【空间组学技术】
24. 24Visium (10× Genomics)：组织切片放在有 spatial barcode 的载玻片上
25. 25原位捕获：mRNA 与载玻片上的 barcode 结合
26. 26文库构建：逆转录 + 扩增 + 测序
27. 27数据解析：将基因表达映射回空间位置
28. 28Codecelled imaging (CODEX)：利用抗体条形码 + 荧光成像进行空间蛋白检测
29. 29
30. 30【单细胞蛋白质组学】
31. 31微量蛋白检测：基于质谱的 Single Cell Proteomics（通量有限）
32. 32抗体条形码策略：AbSeq、REAP-seq 等，使用抗体偶联寡核苷酸标签
33. 33高通量检测：通过测序读取寡核苷酸标签，实现数十至数百种蛋白的检测
34. 34数据整合：scRNA-seq + 蛋白数据整合分析