单细胞转录组测序 (scRNA-seq) 实验指南
高级单细胞分析·2-5天
单细胞转录组测序技术，用于在单细胞层面解析细胞异质性，发现新的细胞类型和功能状态。广泛应用于免疫学、肿瘤学、发育生物学等研究领域。
1实验步骤
- 1样本制备：根据组织类型选择合适的单细胞解离方法
- 2组织处理：新鲜组织小块用 PBS 或专用解离缓冲液清洗，剪刀剪成 1-2mm 小块
- 3酶解：加入胶原酶/胰酶混合液，37℃摇床消化 30-60 分钟
- 4过滤：使用 40μm 细胞滤网过滤，除去未消化组织，收集单细胞悬液
- 5红细胞裂解（如需要）：加入 RBC Lysis Buffer，室温孵育 5 分钟
- 6细胞计数：用血球计数板或自动细胞计数仪测定活细胞浓度，调整至 700-1200 cells/μL
- 7质控：活率 >85%，无明显细胞碎片和团块
- 8油包水GEMs形成：使用 10× Genomics Chromium 或类似平台，将单个细胞与凝胶珠（Gel Beads）和酶混合物包裹在油滴中形成 GEMs
- 9逆转录：GEMs 中进行逆转录反应，生成 cDNA
- 10油相破裂：加入破裂液破油，回收 cDNA
- 11cDNA 扩增：进行 PCR 扩增，获得足够量的 cDNA
- 12文库构建：使用商品化试剂盒进行片段化、接头连接和 PCR 扩增
- 13测序：使用 Illumina 高通量测序平台（NovaSeq/NextSeq）进行测序
- 14数据分析：使用 Cell Ranger、Seurat、Scanpy 等软件进行数据处理、比对、聚类和注释