siRNA 敲降效果验证实验指南

1实验步骤

1. 1【分子水平验证 - mRNA 检测（转染后 24-48 小时）】
2. 2收细胞：用 TRIzol 或 RNA 提取试剂盒提取 total RNA
3. 3逆转录：PrimeScript RT Master Mix 将 RNA 转为 cDNA
4. 4qPCR：目的基因引物 + GAPDH/β-actin 内参引物
5. 5数据计算：ΔΔCt 法计算敲降效率 = 1 - 2^(-ΔΔCt)
6. 6判定标准：mRNA 敲降 >70% 为有效，<50% 建议更换靶点
7. 7
8. 8【分子水平验证 - 蛋白检测（转染后 48-96 小时）】
9. 9收蛋白：RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取总蛋白
10. 10定量：BCA 法定量，调整各样品浓度一致
11. 11Western Blot：SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、一抗（目标蛋白 + 内参）孵育、二抗孵育、显影
12. 12灰度分析：ImageJ 软件分析条带灰度，计算敲降效率
13. 13判定标准：蛋白表达下降 >60% 为有效敲降
14. 14
15. 15【功能表型分析（确认敲降效率后）】
16. 16细胞增殖：CCK-8/MTT 检测细胞活力变化（转染后 24-72 小时）
17. 17细胞凋亡：Annexin V/PI 流式检测（转染后 48-72 小时）
18. 18细胞周期：PI 染色流式检测（转染后 24-48 小时）
19. 19细胞迁移：Transwell/Wound Healing 检测（转染后 12-48 小时）
20. 20其他：根据基因功能选择对应表型实验
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22. 22【时间梯度检测】
23. 23分别在 24h、48h、72h、96h 收样检测，找到最佳检测时间点
24. 24某些蛋白半衰期长（如膜蛋白、核蛋白），可能需要更长时间才能看到敲降效果
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26. 26【多靶点 siRNA 筛选】
27. 27如无法确定最佳 siRNA 靶点，可同时转染 2-3 条不同序列的 siRNA
28. 28筛选敲降效率最高的进行后续功能实验
29. 29注意：不同靶点的敲降效率可能差异很大（20%-90%）