siRNA 转染实验指南
中级分子生物学·1-2天
siRNA（small interfering RNA）是人工设计的、用于诱导 RNA 干扰（RNAi）从而沉默特定基因的核心工具。Lipofectamine RNAiMAX 是最常用的转染试剂，适用于大多数细胞系。
1实验步骤
- 1【siRNA 设计与制备】
- 2设计原则：选择靶基因 CDS 区 21-23nt 序列，GC 含量 30%-52%，避免 5'/3' UTR 区域
- 3BLAST 比对：确保序列特异性，使用在线工具（Dharmacon、Ambion、siDirect）设计
- 4多靶点验证：建议同时设计 2-3 条不同靶点 siRNA，筛选敲降效率最高的
- 5
- 6【制备方法选择】
- 7化学合成：纯度高、可进行化学修饰（如 2'-O-Me、硫代磷酸骨架），成本较高，适合验证阶段
- 8体外转录：成本低、周期短，适合大规模筛选
- 9RNase III 消化：产生 siRNA 混合物，沉默效率高但存在脱靶风险
- 10
- 11【细胞接种】
- 12转染前一天，6 孔板接种 0.5-2×10⁵ cells/well，使次日汇合度达 50-70%
- 13无双抗培养基（Opti-MEM 或 DMEM）培养过夜
- 14
- 15【siRNA-转染试剂复合物配制】
- 16稀释 siRNA：Opti-MEM 稀释 siRNA（终浓度 10-100nM，通常 30-50nM）
- 17稀释转染试剂：Opti-MEM 稀释 Lipofectamine RNAiMAX（通常 5-10μL/孔）
- 18混合：室温孵育 5 分钟（让 RNAiMAX 与 siRNA 结合）
- 19注意：不要过度吹打，轻轻混匀即可
- 20
- 21【转染】
- 22将 siRNA-RNAiMAX 复合物加入细胞，轻轻摇晃混匀
- 2337℃培养 24-72 小时
- 24转染后 4-6 小时可换液，减少试剂毒性
- 25
- 26【严格对照设置】
- 27阴性对照：Scramble 序列（与任何基因无同源性）
- 28阳性对照：已知有效 siRNA（如 GAPDH siRNA）验证转染效率
- 29空白对照：不加 siRNA 的细胞，评估细胞毒性