Western Blot 实验指南

1实验步骤

1. 1蛋白提取：PBS 洗涤细胞 3 次，加入 RIPA 裂解液（含 PMSF 和蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 分钟，12000rpm 离心 15 分钟取上清
2. 2BCA 法测定蛋白浓度：用 BCA 试剂盒测定 OD562，计算样品浓度
3. 3SDS-PAGE 制胶：根据蛋白分子量选择合适浓度（10-60kDa 用 12%，60-100kDa 用 10%，100-200kDa 用 8%）
4. 4上样：每孔 20-50μg 蛋白，加入 5× Loading Buffer，100℃煮沸 5 分钟
5. 5电泳：80V 恒压跑浓缩胶，120V 跑分离胶
6. 6转膜：湿转，300mA 恒流 60-120 分钟（根据蛋白大小调整），PVDF 膜需提前用甲醇激活
7. 7封闭：5% 脱脂奶粉或 5% BSA，室温摇床封闭 1 小时
8. 8一抗孵育：4℃过夜或室温 2 小时
9. 9洗涤：TBST 洗膜 3 次，每次 10 分钟
10. 10二抗孵育：室温 1 小时
11. 11洗涤：TBST 洗膜 3 次，每次 10 分钟
12. 12显影：ECL 发光液显影，凝胶成像系统曝光